研究背景
活体光学显微成像技术可在真实生理环境中直接观察细胞活动、血管动态与免疫响应，是生命科学和医学研究的重要工具。随着脑科学、肿瘤免疫等前沿领域的快速发展，研究者不仅追求更高的空间分辨率，更需要在三维空间中实时捕获快速动态过程，这意味着成像系统必须同时满足看得清（高空间分辨率）、看得深（大成像深度）和看得快（高时间分辨率）。
传统的双光子显微、共聚焦显微和光片显微等技术虽可在一定深度内获得高质量图像，但其逐点或逐面扫描的成像方式从根本上制约了三维体成像速度，难以捕捉脑血流变化、免疫细胞迁移等毫秒至秒级的瞬态生物过程。光场显微技术通过在单次曝光中同时采集样本的空间与角度信息，以计算重建方式实现高速三维成像，有望突破传统扫描技术的速度瓶颈。然而，当光场显微应用于活体厚组织时，离焦背景荧光强、组织散射严重、角度采样稀疏以及深部像差等多重因素共同导致重建结果出现伪影、轴向拖尾和结构失真，严重制约了其在真实生物场景中的应用。
近红外二区（NIR-II, 1000–1700 nm）荧光成像因生物组织在该波段具有更低的光散射，可实现更深的成像穿透深度，为深组织光学成像开辟了新路径。近年来，NIR-II荧光探针的快速发展使活体深组织成像质量显著提升，但如何将NIR-II成像的深穿透优势与光场显微的高速采集能力进行有机融合，同时在厚组织中有效抑制离焦背景与像差干扰，是当前光学显微成像领域亟待突破的技术难题。
导读
近日，我院费鹏、李东宇团队联合深圳大学AIE研究中心王东、张志军团队，在Laser & Photonics Reviews发表研究成果，提出了一种面向活体深组织高速三维成像的选择性照明NIR-II光场显微成像与像差校正隐式神经表示重建（aberration-corrected implicit neural representation, AIR）相结合的新策略。
该研究从光学系统和计算重建两个层面协同创新：在光学系统层面，设计了选择性体照明NIR-II光场显微系统，利用柱面透镜产生光片并结合高速振镜扫描，在单次曝光中实现目标体积的均匀激发和离焦背景的有效抑制，同时通过微透镜阵列分束在相机上形成多视角光场图像；在计算重建层面，提出了AIR重建方法，将三维结构建模为连续的隐式神经函数，并以物理光场前向投影为约束，在自监督框架下实现视角依赖的数字像差校正。
研究团队在活体小鼠中实现了100 volumes/s的体成像速率、550μm（直径）×200μm（厚度）的成像体积及600μm的脑成像深度，并成功将该技术应用于小鼠脑血管药物响应监测、缺血性卒中形成过程的实时观测以及完整皮肤下实体瘤中T细胞的三维追踪，充分验证了该技术在脑科学、血流动力学和肿瘤免疫研究中的应用潜力。
主要研究内容
本研究围绕如何实现活体深组织中的高速、高保真三维成像这一核心问题，从光学系统设计、计算重建算法和生物应用验证三个层面开展了系统性研究。
在光学系统设计方面，研究团队构建了选择性体照明NIR-II光场显微系统。该系统以柱面透镜产生光片，借助高速振镜在单次光场曝光时间内快速扫描目标体积，使成像区域被均匀激发，而焦外背景信号通过狭缝得到有效抑制。荧光信号经微透镜阵列分束后，在相机上形成9个视角的光场图像，供后续三维重建使用。该设计在信号产生阶段兼顾了光场显微的高速体采集与搭配狭缝的光片照明的背景抑制，从源头提升了厚组织成像的信背比。
在计算重建算法方面，团队提出了像差校正隐式神经表示重建方法（AIR）。传统反卷积或数字自适应光学方法（DAO）难以准确建模活体深组织中的复杂波前畸变，常导致血管结构断裂、轴向拖尾及重建伪影。AIR将三维荧光分布建模为连续的隐式神经函数，同时设计逐视角像差预测模块（VAP），通过迭代优化Zernike系数估计各视角中的波前畸变，实现视角依赖的数字像差校正，在自监督框架下从原始光场图像恢复高保真三维结构。在模拟小鼠脑血管数据中，AIR重建的结构相似性指数达到0.91，显著优于DAO和传统反卷积方法。
在生物应用验证方面，研究团队利用自主合成的AIE纳米探针TTT8,4-B NPs，在活体小鼠中开展了三项典型应用验证：第一，利用AIR NIR-II LFM高速成像能力，在活体小鼠中实现了皮层脑血流三维动力学成像，可同时分辨动脉、静脉及毛细血管的血流速度与方向，成像深度达600μm，并首次在光场显微中实现了单血管血流速度的三维定量测量；第二，在去甲肾上腺素药物响应和光栓塞诱导的缺血性卒中模型中，实时记录了血管收缩与舒张的动态过程及血栓形成后血流路径的三维重新分配；第三，通过构建TTT8,4-B NPs-αOX40靶向探针，在完整皮肤下的皮下实体瘤中实现了活化T细胞的三维追踪，获得了多个T细胞在肿瘤微环境中的空间迁移轨迹，验证了该技术在肿瘤免疫研究中的应用潜力。
技术突破与创新点
选择性体照明和自适应像差矫正重建的NIR-II光场显微成像
光学方面，传统光场显微采用宽场激发，焦外区域的大量荧光背景与目标信号发生严重混叠，极大降低了重建图像的信背比和对比度。本研究创造性地将光片照明策略引入光场显微系统：以柱面透镜产生薄光片，通过高速振镜在单次光场曝光时间内快速扫描目标体积，实现亚毫秒级的体积选择性激发。这一设计的巧妙之处在于：既保留了光场显微单次曝光采集多视角信息的固有速度优势，又在信号产生源头大幅抑制了离焦荧光背景，显著提升了厚组织中原始光场数据的质量。配合NIR-II荧光探针在长波长波段散射更弱的物理特性，该选择性照明策略使光场显微在活体脑组织中的有效成像深度拓展至600μm。
算法方面，传统光场重建算法由于视角数受限，存在重建伪影，而活体厚组织中的光学像差更是进一步制约重建质量。AIR方法突破了这一局限：首先，以坐标基的隐式神经函数对三维荧光分布进行连续参数化建模，有效改善了伪影问题；进一步引入逐视角像差预测模块（VAP），利用Zernike多项式对各视角波前畸变进行参数化表征，并通过自监督学习框架联合优化三维结构和像差参数，最终反向生成受像差影响前的三维结构（图1）。该方法无需额外的波前传感器或自适应光学硬件，在保持光场采集速度的同时，实现数字像差校正，使重建的结构在横向和轴向均保持良好的连续性和清晰度，与GT的结构相似性指数（SSIM）达0.91，显著优于现有方法。
a.本研究所用AIR NIR-II光场显微镜（LFM）系统示意图。b.选择性照明NIR-II光场显微镜的光场编码及相应重建原理示意图。采用柱面镜产生光片，经振镜扫描以实现选择性体积照明。激发荧光信号在低串扰条件下经微透镜阵列调制，并由高灵敏度相机采集。比例尺：100 μm。c. AIR算法解码流程，包含隐式神经表示（INR）重建、VAP模块及损失计算。d.对模拟小鼠脑部血管数据进行AIR、DAO及反卷积重建的性能比较。比例尺：100 μm。e.活体小鼠脑部反卷积、DAO与AIR重建结果比较。右侧白框放大区域显示，反卷积和DAO重建结果中存在明显误差，而AIR方法可准确解析。比例尺：100 μm。
活体深组织脑血管三维观测
为了进一步应用AIR NIR-II LFM的性能优势，研究团队开发了长波长、高亮度、大Stokes位移的NIR-II AIE荧光探针，并在活体小鼠中实现了100 volumes/s的体成像速率（远超传统扫描显微镜）和600μm的脑成像深度。在脑血流动力学研究中，实现了单血管水平的三维血流速度定量测量，可同步分辨动脉–静脉–毛细血管网络的血流动态（图2）。
a.活体小鼠脑部血管从皮层表面至600μm深度的体积渲染图像。比例尺：100μm。b.运动皮层表面、300μm及600μm深度处的血管结构。比例尺：100μm。c.白色箭头标示流动染料的血管延时xy及xz最大强度投影（MIP）图像。比例尺：50μm。d.延时三维运动轨迹。e.二维（v2D）与三维（v3D）定量方法所得血流速度比较。f-g.小鼠脑部血管骨架（表面及400μm深度）的颜色编码血流速度。比例尺：100μm。h.血管分割结果显示了图f中血流的动态变化，以及分叉处体积流入与流出速率的守恒。
血管快速药物响应和缺血性脑卒中形成过程动态观测
研究团队不仅验证了技术指标，更将该成像平台应用于两个具有高度临床相关性的生物医学场景：注射去甲肾上腺素后，可高清观测三维血管网中动静脉的管径和血流变化；在缺血性卒中模型中，以高时空分辨率实时捕捉了从血栓形成到血流路径重新分配的完整动态过程，为卒中机制研究提供了三维视角（图3）。
a.去甲肾上腺素实验方案示意图。b.去甲肾上腺素注射前后血管的最大强度投影（MIP）。左图：注射前，右图：注射后。虚线标示注射前后血管直径的变化。比例尺：100μm。c.实验过程中目标动脉和静脉的体积变化。蓝色箭头指示注射时间点。红色线标示注射前标准化直径。d.小鼠注射去甲肾上腺素前后的血流速度比较。e.缺血性中风实验方案示意图。f.缺血性中风前后的三维体积渲染图及xy投影图像。比例尺：100μm。g.缺血性中风发生及血流重分布的延时监测。比例尺：50μm。
皮下实体瘤中的免疫细胞三维示踪
进一步，研究团队通过在NIR-II AIE纳米探针TTT8,4-B NPs上连接抗体，实现对部分T细胞的在体靶向标记。利用建立的三维成像平台，实现了小鼠完整皮肤下实体瘤中T细胞的三维长时程追踪，展示了该技术在免疫治疗疗效评估中的转化潜力（图4）。
a. TTT8,4-B NPs-αOX40制备流程示意图。b.肿瘤实验方案示意图。c.利用AIR NIR-II LFM对皮下肿瘤内血管及T细胞进行双色成像。比例尺：100μm。d.皮下肿瘤中代表性T细胞动态监测。白色箭头指示三个迁移中的细胞。比例尺：100μm。e.皮下实体瘤中T细胞三维体积追踪。左图：反卷积、DAO与AIR重建效果对比。比例尺：100μm。右图：选定区域的放大视图。比例尺：50μm。
a. TTT8,4-B NPs-αOX40制备流程示意图。b.肿瘤实验方案示意图。c.利用AIR NIR-II LFM对皮下肿瘤内血管及T细胞进行双色成像。比例尺：100μm。d.皮下肿瘤中代表性T细胞动态监测。白色箭头指示三个迁移中的细胞。比例尺：100μm。e.皮下实体瘤中T细胞三维体积追踪。左图：反卷积、DAO与AIR重建效果对比。比例尺：100μm。右图：选定区域的放大视图。比例尺：50μm。
结论与展望
本工作发展了一套面向活体深组织快速三维成像的NIR-II光场显微方法，构建选择性体照明NIR-II光场成像系统，提出基于隐式神经表示网络的自适应像差矫正光场重建方法，结合新开发的高亮度NIR-II AIE纳米探针，在活体小鼠中实现100 volumes/s体成像速率、550μm直径×200μm厚度成像体积以及600μm成像深度，成功应用于脑血流动力学、缺血性卒中形成和实体瘤T细胞迁移等生物医学前沿研究。该工作突破了活体光学显微成像中速度、深度和精度的矛盾，为脑科学、血流动力学、肿瘤免疫和药物评价等领域提供了新的技术平台和研究工具。
展望未来，该技术有望在多个方向进一步拓展。在成像深度方面，结合更长波长的NIR-IIb（1500–1700 nm）荧光探针和更高效的光学设计，有望将活体脑成像深度进一步推进至毫米量级。在成像速度方面，结合更高速的相机和并行计算策略，可实现更大体积的实时三维成像。在多模态融合方面，可整合荧光寿命成像、光谱成像等功能信息，实现结构与功能的多维同步观测。此外，AIR重建框架本身也具有广泛的适用性，可扩展至其他计算成像模态，为厚组织中的高保真三维重建提供通用算法基础。
共同一作：钟丰鹤（华中科技大学）、李雪（深圳大学）、黄一航（华中科技大学）、何冕（华中科技大学）
通讯作者：费鹏（华中科技大学）、李东宇（华中科技大学）、王东（深圳大学）、张志军（深圳大学）
原文题目：Fast in vivo deep-tissue 3D imaging with selective-illumination NIR-II light-field microscopy and aberration-corrected implicit neural representation
原文链接：https://doi.org/10.1002/lpor.71525
